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液相色譜流動相的幾點注意事項
發布時間:2017-02-20   點擊次數:781次

一、 流動相溶劑的選擇

1.所選用的流動相溶劑要有一定的化學穩定性,不與固定相和樣品組分起反應,其純度和化學特性必須滿足色譜過程的穩定性和重複性的要求。

2.溶劑應當不幹擾檢測器的工作,溶劑應與檢測器匹配,選擇不影響檢測器正常工作應選擇在測定波長範圍內無吸收的流動相。

3.在製備分離中, 溶劑應當易於除去, 不幹擾對分離組分的回收。

4.溶劑的粘度要小,保證合適的柱壓降。

5.從實用角度考慮,溶劑應當價格低廉,容易購得,使用安全,純度要高。

二、流動相溶劑使用的注意事項

1.流動相溶劑應選擇HPLC的溶劑或依此為標準的溶劑。流動相使用前用0.45μm濾膜過濾、脫氣,清除微粒和灰塵。 在送液泵內,為了防止雜物(固體)進入流路,裝有吸濾器,但網孔徑為10μm,比此更小的顆粒仍然可通過,這會導致流路和柱子堵塞和汙染。為此,建議常用0.45μm濾膜過濾。流動相溶劑須經脫氣,如不脫氣,在溶劑混合時,或壓力溫度變化時容易產生大量氣泡,會導致泵誤動作和輸液不暢,檢測器產生噪聲信號等。

2.流動相恢複到室溫後使用。流動相溫度與室溫相差時,流動相在恢複到室溫前,基線水平很難穩定,特別是發生漂移,也容易產生氣泡等現象。水與有機溶劑混合時,混合液變化大,往往會與室溫相差很大,務必注意。

3.做HPLC流動相的試劑應用HPLC級的、水應用二次蒸餾水,水相流動相需經常更換,防止長菌變質。使用去離子水、針劑水、純淨水(炊用)並不合適、尤其是做梯度洗脫時,水中的不純物會成為鬼峰,從而幹擾分析結果。

4.流動相的pH值過高或過低,流動相使用純水,使用高濃度磷酸鹽緩衝溶液,使用離子對試劑等,均可能造成色譜柱填料被化學破壞,這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修複的

5.用緩衝鹽做流動相時,在使用前和使用後都要用水清洗流路,絕對禁止將緩衝溶液留在流路中靜置或更長時間。

6.若需要使用含鹽的流動相,使用前請過濾。並且使用該含鹽流動相前,色譜柱需先用低比例有機相(有機相含量應不低於10%)的溶液衝洗,以免緩衝鹽析出。流動相若為蒸餾水或含鹽的緩衝液,建議現用現配,以免流動相因滋生微生物而造成柱填料的汙染。

7.進行梯度實驗時要注意梯度變化過程中流動相的互溶性,避免因流動相不互溶而導致的緩衝鹽析出問題。反相係統更換正相係統或正相係統更換反相係統時,用異丙醇置換係統內的儲存流動相後在接柱子。

8.在更換兩種互不相溶的流動相時,中間要用異丙醇溶液清洗過渡。例如:先用甲醇水做流動相,然後在用正己烷做流動相時,一定要先用異丙醇溶液衝洗甲醇水,然後用正己烷衝洗異丙醇,反之也是一樣。在更換流動相時還要考慮色譜柱是否更換。

9.儀器在短期(兩三天)不用時,流路中可以是甲醇或水。儀器在長期不用時,流路中應用甲醇。

10.對於UV等檢測器用於高靈敏度檢測時,要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動相溶劑,如甲醇、乙腈等。

11.當流動相溶劑為乙腈時,流速為1ml/min泵的正常壓力5~7Mpa之間,如果壓力逐漸降低,基線也出現異常。這是由於乙氰的粘性大,導致泵的流速降低。可適當提高流速使泵的壓力恢複正常即可。

12.流動相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、丙酮、四氯呋南、二甲化碸等溶劑,會對流路中的PEEK樹脂管路強度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動相含有鹵素離子的溶劑,如KCI、NaCI、NH4CI等。對流路中的不鏽鋼材料有腐蝕作用,以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時,分析完了後,應立刻用蒸餾水把全流路清洗幹淨。

13.用於檢定梯度等性能時,短時間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的。

14.注意:稀硝酸與甲醇不能混合,否則有可能會引起爆炸。

三、液相色譜流動相的貯存

流動相一般貯存於玻璃、聚四氟乙烯或不鏽鋼容器內,不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表麵的增塑劑,導致溶劑受汙染。這種被汙染的溶劑如用於HPLC係統,可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴,防止溶劑揮發引起組成變化,也防止氧和二氧化碳溶入流動相。

磷酸鹽、乙酸鹽緩衝液很易長黴,應盡量新鮮配製使用,不要貯存。如確需貯存,可在冰箱內冷藏,並在3天內使用,用前應重新濾過。容器應定期清洗,特別是盛水、緩衝液和混合溶液的瓶子,以除去底部的雜質沉澱和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用,所以盛甲醇的瓶子無此現象。

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